多重数字PCR活菌检测：naica®数字PCR系统助力霍乱弧菌活菌绝对定量

福建省疾病预防控制中心于Frontiers in Microbiology（影响因子IF：5.2）发表了名为《Absolute quantification of viable Vibrio cholerae in seawater samples using multiplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide》的研究论文，开发了一种新的检测方法，将三重数字PCR（dPCR）与单氮化丙啶（PMA）处理相结合，定量检测活霍乱弧菌O1/O139和霍乱肠毒素（ctxA）。在模拟海水样品中评价了PMA-dPCR检测活菌源DNA的特异性和敏感性。

dPCR检测中，rfb O1、rfb O139和ctxA的最佳引物浓度分别为1μM，而三种探针的浓度分别为0.25、0.25和0.4μM。最佳退火温度为58°C，以获得最准确的结果。从PMA处理中区分活死细菌的最佳策略是在20 μM浓度下孵育15min，然后暴露于650w卤素灯20 min。

图例说明：不同PMA浓度处理后的死菌(A) /活菌(B) 及不同光照时间后死菌的(C) qPCR结果。ΔCt=对照组PMA-Ct值-处理实验组的Ct值。NT：未经PMA处理的对照组

在纯培养溶液中，霍乱弧菌O1、O139和ctxA的检测限（LODs）分别为127.91 CFU/mL、120.23 CFU/mL和1.5拷贝/反应，而海水样品中三个靶标的LODs分别为150.66 CFU/mL、147.57 CFU/mL和2拷贝/反应。

PMA-dPCR方法的敏感性约为PMA-qPCR方法的10倍左右。当检测活菌浓度分别为1.53×10²和1.53×10⁵ CFU/mL的添加海水样品时，该方法的灵敏度（100%，16/16）高于qPCR（50.00%，8/16），并且有更高的特异性（100%，9/9）。这些结果表明，所开发的PMA-三重dPCR方法在各方面均优于qPCR的方法。

图例说明：使用三重dPCR同时检测霍乱弧菌的两个或三个靶点

图例说明：采用平板计数、qPCR、PMA-qPCR和PMA-triplex dPCR定量不同比例活菌下的霍乱弧菌O1和O139