简 介
癌症仍然是 21 世纪的主要死因之一，虽然肿瘤学方面取得了最新进展，但大多数癌症患者仍缺乏持久的个性化治疗方案，只能通过离体实验评价抗癌化合物及其组合物的影响。目前患者来源的器官样本 (PDOs) 表现出长期扩展潜力，同时也保留肿瘤组织病理学以及癌症基因突变，可作为离体测试可行、有效的模型。但是到目前为止，类器官样品因均质性差、操作困难、自动化方案不理想而使 PDOs 在药物筛选应用中受到了限制。此外，器官样本在培养基中的随机分布，也使得类器官的成像和图像分析变得复杂。
为克服这些挑战，我们使用 Gri3D 平台 (SUN bioscience) 建立了 PDOs 化合物筛选工作流程，该平台由具有适合高通量和可重复类器官培养的微腔板组成。基于标准 96 孔微孔板，每个孔内都含有一个抗细胞粘附的水凝胶微孔。在 Gri3D 上，类器官可在微孔中位于同一成像平面且稳定生长。这极大地促进了基于图像筛选的高内涵 3D 图像采集和定量分析。此外，该移液口可实现自动细胞接种、培养基交换和化合物孵育等实验操作，从而提高检测的可重复性。
在这项研究中，我们将人胰腺癌 PDOs 暴露于一系列不同剂量的抗癌化合物中，并使用活性染料 Calcein AM ( 活染 ) 和 Ethidium Homodimer-1 ( 死染 ) 进行染色，通过高内涵共聚焦成像测试 PDOs 对药物的反应。使用基于 AI 的方法，我们高效地检测到每个类器官样品，并从三个通道 ( 明场、活细胞染色和死细胞染色 ) 中提取与细胞毒性相关表型特征。首先通过 PCA 或 UMAP，将提取样品尺寸特征 ( 超过 100 个 ) 减少到 3 个组分。然后，利用机器学习在 3D 散点图中可视化、排序和聚类处理。数据表明，50μM Palbociclib 具有与阳性对照相似的显著细胞毒性作用，这与传统的活 / 死细胞分析结果一致，证明了使用 AI 驱动对药物筛选进行可靠、公正的数析方法的可行性。
实验室耗材和仪器
Gri3D 是一个用于高通量和可重复类器官培养的即用型平台。基于孔内水凝胶形成的一系列超密集 U 形底微孔，使每个微腔中均能生成单个类器官，并在无固体 ECM 的悬浮培养物中生长。
我们使用配备转盘共聚焦和 sCMOS 相机的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统可捕获整个类器官的 3D 结构。
方法
在 96 孔 Gri3D 500 μm 孔径的微孔塑料板中培养标准化胰腺癌类器官，并用抗癌药物处理其 72 小时。利用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统 (Molecular Devices ) 的透射光 (TL) 对不同时间点类器官进行连续拍摄，而后对类器官进行活 / 死测定。通过 IN Carta 图像分析软件进行图像分析 ( 图 1 )。分析中，对每孔 40 个类器官进行图像分割，并从每个类器官中提取 50 多个指标。最后，利用 StratoMineR 数据分析软件 (Core Life Analytics)对每个类器官相关的特征进行分析。
图 1 类器官药物处理工作流程示意图。该工作流程结合了 Gri3D、高内涵成像系统以及人工智能的图像分析软件 (Molecular Devices )
化合物的表型效应
在 Palbociclib 暴露后，细胞死活的分析中显示类器官的存活率随着药物浓度的增加而下降，而在 trametinib 处理的类器官中未观察明显现象 ( 图 2B )。这种基于深度学习的 TL 图像分析方法，可以有效地检测到单个类器官随时间变化的参数。此外，灰度非正态因子 (GLNN) 可作为类器官灰度值测试指标。如图 2C 所示，这个值随着 Palbociclib 和 Trametinib 剂量的增加而降低 ( 见图 2C )，这些药物会引起类器官的生长缺陷。
图 2 抗癌化合物暴露人胰腺癌 PDOs 72 小时结果。A. TL 图像在曝光前 ( 0 小时 ) 和曝光后 ( 72 小时 ) 以及活 / 死 (Live/Dead) 实验后的类器官的最大投影图像。绿色：Calcein AM，活细胞；红色：EthD-1，死细胞。B.Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 与 Calcein AM 强度比。C. TL 图像的灰度非正态因子(GLNN) 变化。误差显示标准差。每个点代表每个类器官。单因素方差分析 Dunnett 多重比较，**P<0,01，P****<0.0001，ns：不显着。比例尺：250μm。
通过参数降维选择合适条件
IN Carta 数据分析软件提取了 TL、EthD-1 和 Calcein AM 通道中每个类器官相关的数百个特征参数。为了对药物孔和对照孔进行可视化和聚集分析，我们首先通过主要成分分析法将参数降维至三个组分，即 PCA01, PCA02 和 PCA03。然后，我们在 3D 散点图中对药物孔和对照孔进行可视化，其中阴性对照和阳性对照分别形成其自己的簇 ( 图 3 )，药物中 50 uM Palbocilib 是唯一一个聚类更接近阳性对照的处理组 ( 图 3 )，这个观察结果与活 / 死细胞的结果分析一致 ( 图 2 )。此外，从各药物组 (Chebyshev 最大距离 ) 与平均阴性对照的排列中显示，50 uM Palbociclib 排在首位，而四个阳性对照孔排名前六。从这些结果表明，50 uM Palbociclib 对人胰腺癌类器官的效应最为明显。
图 3 通过主要成分分析进行聚类和排序。A.、B.、C. 与原始功能有加权关联的三个 PCA 组分。D. 三种 PCA 成分的 3D 散点图。E. 药物组、对照组与平均阴性对照的 Chebyshev 最大距离排序。
UMAP
为了验证我们的分析，我们使用统一流形逼近与投影法 (UMAP) 减少特征参数的维度情况。考虑到所有特征，聚类图也显示了聚类接近阳性对照的 50 uM Palbociclib 处理组。为确定我们是否能够仅用明场图像区分表型变化，我们仅使用 TL 通道的特征进行分析，但是所得的 3D 散点图显示没有明显的聚类特征，这表明需要添加其他的特征进行聚类。
图 4 UMAP 降维和聚类。A. 所有特征的 UMAP 组份的 3D 散点图。B. 仅 TL 通道特征的 UMAP 组份的 3D 散点图。
概要
Gri3D 是一个用于高通量和可重复类器官培养的平台。
ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统可捕获高通量和高分辨率的类器官 3D 结构。
IN Carta 图像分析软件为每个类器官生成 mask，并测量与每个类器官相关的数百个特征参数。
StratoMineR 数据分析软件利用人工智能对每种药物处理进行聚类和排列分析。
关于美谷分子仪器
Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。
