利用酶标仪测定蛋白相互作用

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链，经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质，在一个生物体中，甚至于一个细胞中，都有很多种不同的蛋白质，它们具有不同的形状、大小和功能，在生物体中行使不同的功能。蛋白质是生物体内最重要的生物大分子之一，它们在生命活动中扮演着极其重要的角色。蛋白质的功能多种多样，主要包括以下几个方面：结构功能、催化功能、运输功能、调节功能、免疫功能、储存功能、运动功能、保护功能、信号传导功能、基因调控功能等。蛋白质的多样性和复杂性使得它们在生物体中发挥着不可替代的作用，蛋白互作对解析生命过程至关重要。随着时代发展，虽然大规模高通量的生物学研究手段大大促进了蛋白互作的预测，但这些预测还需要进一步验证，除了免疫共沉淀（Co-IP），融合蛋白 pull down，表面等离子共振 SPR 等检测方法外，通过酶标仪也可对蛋白互作进行研究测定。

荧光偏振（Fluorescence polarization，FP）是一种通过酶标仪检测大分子与小分子是否发生相互作用的检测方式。大、小分子未结合时，荧光标记的小分子运动速度快，发射光去偏振化，检测到低的毫偏振值（mP）；而当荧光标记的小分子与生物大分子结合后，旋转变慢，发射光保持偏振性，检测到高的 mP，通过毫偏值（mP）可以判断大分子与小分子是否发生相互作用。下面介绍两篇使用 FP 进行检测的文章:

内切酶是切割单链 DNA 或 RNA 内部磷酸二酯键的酶，对生物功能至关重要。本研究中，科研人员构建了一种非天然的内切酶，该内切酶切割非编码RNA，这是自然界中不存在的功能。然后引入一种金属螯合的非天然氨基酸丙氨酸（BpyAla），赋予 RNA 沉默蛋白 p19 病毒抑制因子内切酶活性。在与铜离子结合后，突变体 p19-T111BpyAla 可以对 siRNA 和人类 miRNA 的催化位点特异性切割，通过荧光偏振证实了催化作用。该研究论文“An unnatural enzyme with endonuclease activity towards small non-coding RNAs”发表在 Nature Communications 杂志上。

研究人员将 p19-T111BpyAla 与荧光标记的 siRNA 一起孵育。随着时间的推移，观察到极化减少，这与底物的裂解和释放一样。荧光标记的 RNA 从酶中释放出来，导致更快的旋转，从而降低偏振信号。荧光偏振分析测量了荧光团标记 RNA 的偏振程度，以及通过平行光和垂直光的比率测量的荧光偏振的变化。通过荧光偏振（FP）检测证实了小 RNA 的水解切割是由于 BpyAla 在 p19 中的特异性位点引起的（图1）。

图1. 荧光偏振检测结果

真核生物包含两组基因组：核基因组和线粒体基因组。线粒体核糖体的正确组装和成熟对于 13 种关键蛋白质的翻译和线粒体的功能至关重要。人核糖体结合因子 A（hsRBFA）是一种有丝分裂核糖体组装因子，hsRBFA 的故障会导致线粒体核糖体的不稳定，影响线粒体的功能，但 hsRBFA 与 12S rRNA 相互作用及其对线粒体功能影响的机制尚不清楚。本研究中，科研人员发现 hsRBFA 通过其整个N端（Nt）与双毒株 RNA（dsRNA）结合，而不是仅与KH样结构域结合。此外，该研究绘制了影响 RNA 结合和体外有丝分裂核糖体形成的关键残基。最后，科研人员详细系统地研究了这些残基如何影响线粒体功能。该研究论文“The recognition mode between hsRBFA and mitoribosome 12S rRNA during mitoribosomal biogenesis”发表在 Nucleic Acids Research 杂志上。

由于 hsRBFA 的 Nt 对 hsRBFA 和 12S rRNA 之间的相互作用有更大的贡献，研究人员对 hsRBFA Nt 如何与 dsRNA 片段结合的分子细节进行了分析。首先分析了其 Nt 结构域的氨基酸序列，证明 hsRBFA 识别 dsRNA 没有序列区分，因此预测只有基本残基会参与相互作用，然后通过三次突变，RNA 结合实验的结果表明，带正电荷的氨基酸的突变消除了 RNA 结合能力，但带负电荷的残基不影响 dsRNA 结合。研究人员将 9 个残基分为两个亚组，EMSA 结果表明，这两个亚组对于 hsRBFA 与 dsRNA 的结合都很重要。任意一个亚组的突变都部分消除了 dsRNA 结合能力，为进一步确认结果的真实性，使用荧光偏振（FP）定量分析 dsRNA 结合亲和力的差异（图2），结果与 EMSA 结果一致。因此，研究人员认为 hsRBFA 与 12S rRNA 的结合主要取决于其 N 端的碱性氨基酸残基。

图2. 荧光偏振检测结果展示

FRET 是指两个荧光探针分子之间在特定的条件下产生一种非辐射的能量转移现象，不同的荧光探针，如果供体的发射光谱与受体的激发光谱有一定的重叠，且二者的空间距离不超过 10 nm，则供体荧光分子激发后可诱发受体分子发出荧光。FRET 程度与供受体分子的空间距离紧密相关，随着距离变远，FRET 程度减弱（图3）。

图3. 共振能量转移示意图

传统荧光染料，荧光寿命短，易受到样品自发光干扰，使用镧系元素标记后，荧光寿命长，灵敏度高，标记稳定，线性范围广。并且激发受体后，后者发射时间会延长，比一般 FRET 信号更强，更稳定（图4）。HTRF 是 TR-FRE 的改良技术，受体是一个镶嵌铕的穴状化合物，荧光寿命短，不易与 EU 发生结合，更稳定。

图4. 时间分辨荧光共振能量转移示意图

BRET 与 FRET 相比，供体采用萤光素酶生物发光，不需要激发光，无荧光淬灭等问题，没有样本自发光干扰，背景低，性噪比高（图5）。

图5. 化学发光-荧光共振能量转移技术示意图

Alpha 是一种基于增强的化学发光的均相免疫技术，已广泛用于各项生物实验的研究，其包括 AlphaScreen 和 AlphaLISA 技术， 两种方法使用同一种供体微珠，不同的受体微珠。AlphaScreen 技术是基于生物分子物质的相互作用的原理发展起来的，如抗原抗体反应、蛋白相互作用等，通过分子之间的相互作用形成供体微珠、受体微珠和相互作用分子的复合物。使用 680 nm的激光激发供体微珠导致单线态氧分子释放，引发能量转移级联反应，受体微珠发射 520-620 nm的光波， 具有较强的抗淬灭能力。若生物分子不存在特异的相互作用，单体氧将无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。AlphaLISA 技术是在 AlphaScreen 技术的基础上发展而来，其发射峰在 615 nm处，避开了血清以及组织中其他成分的发射峰。与 AlphaScreen 相比，AlphaLISA 的发射光不易受到 500-600 nm吸收光的干扰，无论这种干扰是来自人工合成的化合物或是天然产物（如血红蛋白等），从而使检测的背景降至最低（图6）。

图6. Alpha 实验原理图 

4. Xu, TH., Liu, M., Zhou, X.E. et al. Structure of nucleosome-bound DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B. Nature 586, 151–155 (2020).