上期我们探索了中医药在肝脏疾病中的研究进展，从药效的角度解释传统中药成分保肝护肝的作用机制。本期我们将从非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）药物筛选的角度出发，为大家解读 Visikol 公司在肝脏药物筛选中目前正在进行的工作。
NASH 和 NAFLD 的早期阶段被认为是可逆的，研究人员一直在努力开发逆转这一过程的治疗方法，但收效甚微。开发治疗方法的主要困难之一是缺乏能够准确代表肝脏 NASH 或 NAFLD 疾病进展的预测性体外模型。由此导致了几次晚期临床试验的失败，药物开发的成本和时间也显著增加。3D 细胞模型的快速崛起，为 NASH 和 NAFLD 的药物开发和治疗带来巨大潜力。与传统的二维（2D）细胞培养相比，3D 细胞模型能够更好地模拟体内微环境，提供更准确的疾病机制和药物反应数据。但是，即使有了合适的三维模型，其成像和分析也极具挑战性，主要因为三维样品的处理难以实现均匀的标记，加上样品内部很强的散射效应，图像质量在较厚的样本中迅速下降。此外，3D 成像产生的大量数据如何分析和有效提取也是关键挑战之一。
Visikol 是美国一家专注于生物成像和分析的合同研究服务公司，提供多种产品，用于支持药物研发和生物医学研究。其特色之一是利用 3D 细胞培养和高内涵成像服务高效地进行药物筛选和疾病建模，加速 NAFLD 和 NASH 药物的研发。
解决方案
Visikol 团队开发了几种 3D 细胞培养模型用于重建肝脏内的组织微环境，模拟 NASH 和 NAFLD 的疾病进展。这些模型通过 3D 共聚焦高内涵成像系统（Molecular Devices， ImageXpress Micro Confocal）结合其他方法进行评估，可量化药物能够在多大程度上改善 NASH 中的纤维化进程。
Visikol 团队使用的 ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像分析系统。
其中一种用于非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的共培养模型，采用了异质细胞培养成球的模式，将原代人肝细胞（PHH）与原代人肝非实质细胞（NPC）共培养在超低吸附U型底板中，使用标准培养条件持续培养 14 天，让球体直径生长到约 200 μm大小。球体形成后，加入待测化合物预处理并添加 TGF-β 持续诱导 72 小时以产生纤维化。球体形成的第 5 天到第 14 天，通过 FFA（棕榈酸和油酸）诱导出 NASH 样表型。然后收集汇总细胞球，用于各种终点检测，如 RNA 提取、免疫荧光标记、高内涵成像和目标蛋白的 ELISA 检测等。
在成像方面，Visikol 团队使用共聚焦高内涵成像系统结合 Visikol HISTO-M 透明化试剂，可以实现完整三维细胞模型的 3D 成像。MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件可采集每个孔板的全景预览图（每个孔中有一个细胞球）。每个球体采集 20 个Z轴层扫数据，平均总厚度为 150 μm~250 μm。生成的图像可显示多种免疫标记的信号，包括 Albumin、Vimentin、CD68、CD31 和 DAPI 等，表示 3D 体外模型中的肝细胞亚型比例与天然人类肝脏中的比例相符。
HepaRG NP 3D 模型用 DAPI（蓝色）标记，从左到右分别为 Albumin（红色；肝细胞）、pan-cytokeratin（绿色；胆管细胞）、CD31（红色；肝内皮细胞）、CD68（绿色；Kupffer 细胞）、Vimentin（黄色；肝星状细胞）（Visikol 官网）。
这种成像模型可使研究人员能够观察到化合物与细胞的相互作用，从而了解化合物在临床试验中可能对人产生的影响，也可揭示模型中细胞活性与化合物之间的关系以及分析模型中形成的瘢痕组织。
Visikol HepaRG 和非实质细胞共培养的 3D 细胞球在用 100 nM TGF-β 诱导纤维化前 1 小时，分别用对照或 ALK-5 抑制剂预处理 48 h。在上述图像中，DAPI 为蓝色，活细胞为绿色，胶原蛋白为红色。对每个 3D 细胞培养模型的胶原蛋白荧光强度和体积进行量化。可以看出，TGF-β 降低了活细胞数量和球体大小，并且沉积了胶原蛋白，而 ALK-5 抑制剂能够部分改善细胞活力和减少胶原蛋白沉积 （Visikol 官网）。
ImageXpress Micro Confocal 高内涵解决方案，可以在固定和活细胞的宽场和共聚焦成像之间切换，能够捕捉整个生物体、厚组织、二维和三维模型以及细胞或细胞内事件的高质量图像。转盘共聚焦和 sCMOS 相机能够成像快速生物学过程，如心肌细胞跳动和干细胞分化。借助 MetaXpress 软件，该系统支持从常规 2D、3D 成像到筛选的多种成像应用。
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