内容摘要
SUMMARY
01
人滤泡树突状细胞（follicular dendritic cells, FDCs）在抗体发展中发挥着至关重要的作用，它们通过向生发中心的 B 细胞呈递抗原来促进抗体的产生。近期题为“Protocol for the isolation and purification of human follicular dendritic cells for functional assays”在STAR Protocols上发表【1】，详细介绍了如何从淋巴组织中分离和纯化FDCs。其中，酶解消化下的淋巴结细胞进行荧光标记后，通过Sony MA900流式细胞分选仪实现FDCs纯化富集，并成功应用于扁桃体、淋巴结和三级淋巴结构等各类淋巴组织。这一稳健技术不仅可分离富集FDCs，更促进其下游的功能鉴定，对于理解免疫反应和开发新的免疫治疗方法具有重要意义。
材料与试剂
MATERIALS
02
图1. 主要材料列表
实验步骤要点
PROTOCOLS
03
间质细胞分离
1. 使用胰蛋白酶消化扁桃体组织
a. 组织处理：
时间控制：组织处理应在手术切除后尽快进行，理想情况在2小时内开始，以保持细胞活力。
温和操作：使用镊子和剪刀轻轻处理组织，避免过度研磨导致细胞损伤。
冰浴： 除包被培养板外，所有步骤均在冰浴中进行，以保持细胞活力。
b. 消化过程：
温和搅拌：添加消化混合液后，枪头轻轻搅拌，避免过度搅拌导致细胞损伤。
消化时间：消化时间不宜过长，以免细胞活力下降。通常进行3次消化，每次15分钟。
温度控制：消化过程在 37°C 水浴中进行，以促进消化酶活性。
图2. 组织消化混合液
2. 通过Percoll 密度梯度离心分离间质细胞
Percoll 溶液：使用前需进行稀释，并确保不同密度溶液之间无明显界面。
离心速度和时间：按照 300g 离心 25 分钟进行离心，以确保 FDCs 精确分离。
细胞收集： 滴管收集 21% 和 34% Percoll 之间的细胞层，避免混入杂质。
3. 计数并准备间质细胞悬液进行 FDC 富集
细胞计数：使用细胞计数器或显微镜进行细胞计数，确保细胞染色浓度适宜。
Sony MA900流式分选仪富集FDCs
1. 染色流程
图3. 抗体列表
图4. Sorter buffer列表
2. 污染控制
无菌操作：所有操作均在超净工作台中进行，避免污染。
抗生素：在培养基中添加抗生素，预防细菌和真菌污染。
清洁消毒：定期清洁和消毒实验器材，防止交叉污染。
图5. FDCs流式及镜检结果
索尼流式亮点
PUNCH LINE
04
实验结果发现，间质细胞经过消化和Percoll富集分离后，细胞产量约为 10^5 - 10^7 个，主要取决于扁桃体大小。对于FDCs的富集，作者除了流式分选纯化也尝试了磁珠富集，并发现通过MojoSort 磁珠富集后，FDCs 产量约为 10^2 - 10^4 个；通过Sony MA900 流式分选仪富集后，FDCs 产量约为 10^3 - 10^4 个。
Sony作为全自动分选技术的开创者和领导者，采用创新的微流控技术，在智能化程度、分选活性、杜绝交叉污染等多方面相较传统分选方式有了根本性的优化和提升。Sony MA900多功能全自动分选仪是本文中用于精确分离FDCs的关键工具，可从基质细胞中分离出FDCs，且分选精度更高。
Reference：
[1] Breeuwsma M, Heesters BA. Protocol for the isolation and purification of human follicular dendritic cells for functional assays. STAR Protoc. 2023 Sep 15;4(3):102404. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102404. Epub 2023 Jun 30. PMID: 37392392; PMCID: PMC10336301.
