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【文献分享】Sony MA900助力人滤泡树突状细胞的分离富集

阅读数:0
2024-10-14
海报分享

内容摘要


SUMMARY


01

人滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDCs)在抗体发展中发挥着至关重要的作用,它们通过向生发中心的 B 细胞呈递抗原来促进抗体的产生。近期题为“Protocol for the isolation and purification of human follicular dendritic cells for functional assays”在STAR Protocols上发表【1】,详细介绍了如何从淋巴组织中分离和纯化FDCs。其中,酶解消化下的淋巴结细胞进行荧光标记后,通过Sony MA900流式细胞分选仪实现FDCs纯化富集,并成功应用于扁桃体、淋巴结和三级淋巴结构等各类淋巴组织。这一稳健技术不仅可分离富集FDCs,更促进其下游的功能鉴定,对于理解免疫反应和开发新的免疫治疗方法具有重要意义。

材料与试剂


MATERIALS


02

图1. 主要材料列表

实验步骤要点


PROTOCOLS


03

1


间质细胞分离

1. 使用胰蛋白酶消化扁桃体组织

a. 组织处理:

  • 时间控制:组织处理应在手术切除后尽快进行,理想情况在2小时内开始,以保持细胞活力。

  • 温和操作:使用镊子和剪刀轻轻处理组织,避免过度研磨导致细胞损伤。

  • 冰浴: 除包被培养板外,所有步骤均在冰浴中进行,以保持细胞活力。

b. 消化过程:

  • 温和搅拌:添加消化混合液后,枪头轻轻搅拌,避免过度搅拌导致细胞损伤。

  • 消化时间:消化时间不宜过长,以免细胞活力下降。通常进行3次消化,每次15分钟。

  • 温度控制:消化过程在 37°C 水浴中进行,以促进消化酶活性。

图2. 组织消化混合液


2. 通过Percoll 密度梯度离心分离间质细胞

  • Percoll 溶液:使用前需进行稀释,并确保不同密度溶液之间无明显界面。

  • 离心速度和时间:按照 300g 离心 25 分钟进行离心,以确保 FDCs 精确分离。

  • 细胞收集: 滴管收集 21% 和 34%  Percoll 之间的细胞层,避免混入杂质。


3. 计数并准备间质细胞悬液进行 FDC 富集

  • 细胞计数:使用细胞计数器或显微镜进行细胞计数,确保细胞染色浓度适宜。

2


Sony MA900流式分选仪富集FDCs

1. 染色流程

a. 细胞重悬于100μl sort buffer,加入FDC antibody mix 冰上避光孵育30分钟。
b. 用2.5 mL sort buffer 洗涤细胞,离心200g 5分钟。
c. 将细胞在sort buffer中重悬至浓度为3*10^7个细胞/ mL。
d. 在分选前,每1ml细胞悬液中加入2.5 mL helix-NP,以区分活细胞和死细胞。
e. 使用索尼MA900细胞分选仪,100μm喷嘴芯片,对细胞进行分选。每对扁桃体FDCs产量在10^3-10^4个。
f. 将细胞在FDC培养基中收集培养。

图3. 抗体列表

图4. Sorter buffer列表

2. 污染控制

  • 无菌操作:所有操作均在超净工作台中进行,避免污染。

  • 抗生素:在培养基中添加抗生素,预防细菌和真菌污染。

  • 清洁消毒:定期清洁和消毒实验器材,防止交叉污染。

图5. FDCs流式及镜检结果

索尼流式亮点


PUNCH LINE


04

实验结果发现,间质细胞经过消化和Percoll富集分离后,细胞产量约为 10^5 - 10^7 个,主要取决于扁桃体大小。对于FDCs的富集,作者除了流式分选纯化也尝试了磁珠富集,并发现通过MojoSort 磁珠富集后,FDCs 产量约为 10^2 - 10^4 个;通过Sony MA900 流式分选仪富集后,FDCs 产量约为 10^3 - 10^4 个。

Sony作为全自动分选技术的开创者和领导者,采用创新的微流控技术,在智能化程度、分选活性、杜绝交叉污染等多方面相较传统分选方式有了根本性的优化和提升。Sony MA900多功能全自动分选仪是本文中用于精确分离FDCs的关键工具,可从基质细胞中分离出FDCs,且分选精度更高。


Reference:

[1] Breeuwsma M, Heesters BA. Protocol for the isolation and purification of human follicular dendritic cells for functional assays. STAR Protoc. 2023 Sep 15;4(3):102404. doi: 10.1016/j.xpro.2023.102404. Epub 2023 Jun 30. PMID: 37392392; PMCID: PMC10336301.






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