高内涵活细胞成像研究多糖对巨噬细胞形态的影响

1. 96 孔板

2. 小鼠巨噬细胞 Raw264.7 细胞株 (中科院上海生化所)

3. ASPII，GLPII，OGPII 粗提物 (西安源森生物科技有限公司)

4. 脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) (Sigma, catalog number: SMB00610)

5. DMEM 高糖细胞培养基 (Gibco, catalog number: 11965092)

6. 胎牛血清 (Gibco, catalog number: 16140071)

7. 青霉素-链霉素溶液 (碧云天生物技术, catalog number: ST488)

8. DMEM 高糖培养基 （见溶液配方）

1. 高内涵系统 (Molecular Devices, ImageXpress Micro XLS)

2. 二氧化碳细胞培养箱 (Forma™ Series 2 CO₂ Incubator, Thermal Scientific)

1. 收集对数期生长的 Raw264.7 细胞，按 5×10³/孔的细胞数接种于 96 孔板，铺板完成后，置于细胞培养箱中培养，期间观察细胞生长状态。

2. 过夜培养细胞贴壁之后，吸去上层培养基，分别加入空白培养基和含有 40 µg/mL 的APSII、GLPII、OGPII 以及 100 ng/mL 的 LPS 的 100 µl/孔的培养基。

3. 立即将 96 孔板放入高内涵系统中，设置拍摄参数（注 1：具体操作方法如下）：20x的物镜，每个孔选 7 个位置拍照，每次拍照间隔 20 min，连续拍照 36 h。

4. 根据高内涵成像与分析得到每个细胞的面积及周长，在 Matlab 编程分析的基础上，定义 D 为 D=1 - (4π*面积)/(周长 ²)。当细胞越接近标准圆形，D 接近 0，反之 D 增大。

注 1：高内涵系统成像具体操作方法：进入 HCS 系统后，点击  按钮，将处理好的待测 96 孔板放置在高内涵仪器载物台上。点击“Screening”，选择 “Plate Acquisiti on Setup”，进行参数设置。打开参数设置界面，修改“Names and Description”对任务名称进行编辑；“Objective and Camera”选择 20×物镜，“Plate name”格式选择“96 well zls”，单击选择 6×10 的拍摄区域（绿色），右击将镜头转至拍摄孔（黑色），每孔随机选择 7 个位置进行拍摄，拍摄时间点(number of timepoints)选择“1”，波长选择“2”， Autofocus 设置保持不变。点击“Test settings”观察拍摄的图片是否清晰，若图片不清晰，则可点击“Calculate Offset”按钮 ，连续拍摄 24 张图片，再手动调焦至图片清晰为止，下面其他参数设置保持不变。全部参数设置完毕后，点击“Summary”，选中“Acqure Plate”进行全板拍摄（一般 10 min 左右）。

中药多糖的粗提物首先经过超纯水溶解离心后经无水乙醇纯化，使用 DEAE-32 纤维素离子交换层析，浓缩透析除盐后，真空冷冻干燥得到多糖的干燥样品，最后通过凝胶过滤，旋蒸浓缩，透析除盐并真空冷冻干燥，得到多糖的精细组分 (Lv et al., 1998)。其中，采用高效渗透凝胶色谱法测定到 GLPII 多糖分子量为 15.1 KDa，还原水解法分析单糖组分得到 GLPII 主要含有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为 18.6:38.81:2 5.63。

使用 DEAE-32 纤维素离子交换层析及凝胶过滤层析的方法对多糖粗提物进行精提。具体方法如下：

DEAE-32 cellulose 的预处理如下：取 50g DEAE-32 cellulose 填料，经双蒸水溶胀后静置 1 h；去上层漂浮颗粒后煮沸 2 h 后抽滤除水；填料于 0.5 M NaOH 溶液，用蒸馏水洗至中性，抽干；再于 0.5 M HCl 中充分搅拌浸泡 2 h，用蒸馏水洗至中性，填料重悬待装柱。装柱完成后，用双蒸水以 1 mL/min 的流速平衡过夜。

取粗多糖充分溶解于双蒸水中，12,000 rpm 离心 10 min，取上清上样于 DEAE-32cellulose 离子交换层析柱。首先用双蒸水洗脱中性组分，再用 NaCl 溶液分别洗脱酸性组分并收集。待收集完成后，做出洗脱曲线取各个洗脱峰，浓缩透析除盐后，真空冷冻干燥。

凝胶过滤层析填料的预处理：选择 Sephacryl S-300 HR 作为凝胶过滤介质，取填料反复洗涤，适量双蒸水重悬后装柱，装柱完成后平衡层析柱。

分别取经离子交换层析的不同组分的多糖样品，溶解于 0.2 M 的 NaCl 溶液中，12,000 rpm 离心 10 min，取上清上样于凝胶柱（2.6×100 cm），以 0.2 M 的 NaCl 溶液进行洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测多糖含量变化，分别收集适当的洗脱峰，悬蒸浓缩后透析除盐，真空冷冻干燥，得到多糖的精细组份。

图 1. 高内涵细胞成像获得中药多糖对 Raw264.7 巨噬细胞形态变化的影响。图片分别为 40 µg/mL 的 APSII、GLPII 和 OGPII 以及 100 ng/mL 的 LPS 孵育 24 h 后细胞的形态变化。比例尺为 100 µm。

与对照组相比，APSII 组和 GLPII 组能够显著改变 Raw264.7 细胞形态，刺激细胞变大并且使得细胞表面形成树枝状突出，这与典型的树突状细胞形态很相似，说明上述两种中药多糖具有诱导巨噬细胞分化成熟的能力。而相比之下，OGPII 对 Raw264.7 细胞形态的改变并没有明显的影响 (图 1)，说明 APSII 和 GLPII 在刺激细胞形态变化的效果显著高于 OGPII。

此外，采用了高内涵活细胞成像技术来研究 GLPII 对 Raw264.7 细胞分化的影响。应用高内涵活细胞成像系统，细胞连续培养 36 h，期间每隔 20 min 成像一次，记录细胞形态变化。图 2 提供了细胞在不同时间点的形态变化，可清楚地看到细胞从 0 h 到 36 h 的生长分化情况：细胞逐渐变大并且有树突伸展出。

图 2. 高内涵活细胞成像研究多糖对 Raw264.7 细胞分化的影响。由 40 µg/mL 的GLPII 诱导的细胞分化成熟过程，图中所示分别为在 0、6、12、18、24、36 h 时细胞的形态。

为了定量表示细胞分化过程形态变化，我们定义了“细胞不规则”这一概念，取绝对圆形的细胞为“0” (Raw264.7 细胞在未加任何处理的条件下是一种圆形的细胞)，随着细胞的分化，细胞形态不规则度数值也在上升，取 100 ng/mL 的 LPS 刺激细胞 48 h 之后引起的形态变化定义为“1”。各类中药多糖引起细胞分化的不规则度变化如图 3 所示，对照组在 36 h 内细胞形态并没有明显变化，不规则度数值在 0.06-0.3 之间波动，24 h 之后该数值还有一定程度的下降，猜测可能是由于细胞增殖出现接触抑制，使细胞形态变得更圆。

图 3. 根据高内涵成像与 Matlab 分析得到每个细胞的面积及周长，从而获得不同多糖随时间变化对 Raw264.7 细胞不规则度的影响。关于“细胞不规则度”的定义：完全圆形的细胞的不规则度为“0”，而将 100 ng/mL 的 LPS 在 48 h 时引起的细胞形态的改变定义为“1”。

各实验组都能够显著提高细胞不规则度，其中，GLPII 在引起细胞分化方面的效果最为明显，APSII 和 OGPII 的效果要弱一些。纵向比较这三组多糖，细胞不规则度在 10 h 内上升较快，而在 30 h 之后逐渐达到最高值。此外，这三种多糖均能够导致巨噬细胞分化成类似树突状细胞形态的细胞，而这种诱导细胞形态变化的能力在最初的 12 h 内基本相似，在此之后 GLPII 的效果要高于 APSII 和 OGPII，甚至高于作为阳性对照的LPS 组。

图 4. 不同浓度 GLPII 引起 Raw264.7 细胞分化成熟的程度。图示利用了 1.25-40µg/ML 的 GLPII 给药达到 36 h。在给药的最初 10 h 内，形态变化与浓度的依赖并不强；给药 10 h 后由浓度不同造成的细胞分化差异逐渐显现出来。

另外单独分析了 GLPII 组，发现 GLPII 引起 Raw264.7 细胞分化与多糖呈浓度依赖性关系 (图 4)，在最初 10 h 内，形态变化与浓度的依赖并不强；之后，由浓度不同造成的细胞分化差异逐渐显现出来，在细胞不规则度到达峰值的 30 h 之后，浓度差异最为明显。此外，GLPII 的浓度在低至 1.25 g/mL 也足以引起细胞形态变化。

1. DMEM 高糖培养基

配制含 10% 胎牛血清、2% 青霉素链霉素的 DMEM 高糖培养基用于培养 Raw264.7 巨噬细胞，于 4 °C 保存。

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