斑马鱼是一种理想的高通量毒性测试模式生物，在医学、生命科学、毒理学等学科研究中被广泛应用。面向国家“重视新污染物治理”的重大需求，亟需发展基于斑马鱼的化学品毒性高通量筛选技术。本文主要由东北师范大学环境学院李超老师团队与信息科学与技术学院王玉茹团队，以及美谷分子仪器（上海）有限公司合作，共同开发了利用高内涵成像与AI图像分析结合的技术，旨在利用斑马鱼表型数据，开展高风险毒性污染物高通量筛查与健康评价。
简 介
1. 污染物暴露与斑马鱼成像
使用健康 AB 型野生斑马鱼、Tg (myl7: eGFP) 心脏转基因斑马鱼胚胎进行不同剂量的污染物暴露 (助溶剂 DMSO 的含量小于 0.2%)。待斑马鱼暴露至 72 hpf 后，转移至黑色透明 96 孔板中。使用 MS-222 麻醉幼鱼，将孔板以 200 rpm 离心 2 min，使斑马鱼侧躺。
随后使用 ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统 (Molecular Devices) 在明场和 FITC 荧光场下进行图像采集 (图 1)。设置成像程序参数如下：选择 4X Plan Apo 物镜，每孔拍摄视野数量 2×2，各个视野紧邻；选择激光自动聚焦 (对焦到板底部，按底板厚度偏移) 和 Z 层垂直拍摄；针对荧光心脏图像采集，选择 FITC 通道，聚焦方式选择 Laser with z-offset，选择数字共聚焦，调整曝光时间和曝光强度，直到心脏图像聚焦清晰，进行拍摄。
特别指出的是，对于心脏转基因斑马鱼，采集荧光图像、视频及平均荧光强度数据。对心脏转基因斑马鱼进行心脏跳动视频的制作，选择 Stream Acquisition，拍摄帧数为 250 帧，选择 Make movie 选项，选择 100 帧图片进行 15s 视频制作。
2. 特征提取
使用 Labelme 对所采集的图像数据集进行标注，获取斑马鱼幼鱼鱼身、头部、眼睛、心包、卵黄囊共计 5 个身体表型参数，以及心脏区域的心房和心室收缩和舒张时的组织轮廓、心室的长轴和短轴共计 8 个参数。基于心跳平均荧光强度数据，计算心率、RR 间期、QT 间期和 QTc 间期指标。其他心脏功能评估指标 (心室舒张末期体积 (EDV)、心室收缩末期体积 (ESV)、心室舒张末期面积 (EDA)、心室收缩末期面积 (ESA)、每搏输出量 (SV)、心室短轴收缩率 (FS)、射血分数 (EF)、面积变化分数 (FAC)、心输出量 (CO)) 则基于心率及心室的长轴、短轴和面积计算而得。
3. 深度学习模型构建
基于拍摄的图像，使用 ImgAug 开发库进行数据增强，最终获得 3650 张图像用于构建识别斑马鱼体长的模型，获取 3465 张图像用于构建识别斑马鱼头部、眼睛、心包、卵黄囊区域的模型，获取 3051 张图像用于构建识别斑马鱼心房及心室区域的模型。将增强后的图像数据集进行划分，其中 80% 作为训练数据，10% 作为验证数据，10% 作为测试数据。通过 YOLOv8 网络，结合 OpenCV 形态学操作等方法，开展斑马鱼幼鱼的体表和心脏形态的分析，通过识别并检测各个部位的形貌特点，提取表型特征 (5 个身体表型，8 个心脏表型参数)。其他心功能参数则基于心脏表型参数计算获得。最终，构建在明场下对斑马鱼体表形态识别的模型和在荧光场下对斑马鱼心脏形态识别及功能评估的模型，实现对斑马鱼图像的批量处理测量和评估。基于构建的方法，可开展各类化学品对斑马鱼的发育毒性和心脏毒性的高通量筛查。
图 1 化学品暴露、图像采集及表型分析的流程。
1. 斑马鱼身体表型特征识别和分析
构建的模型可基于一张明场下斑马鱼图像，识别、检测、定量输出鱼的头部、眼睛、心包以及卵黄囊的面积及鱼身长度 (图 2)。从表 1 可以看出，构建的模型对 5 个部位识别的性能指标如下：精度均大于 0.935，召回率均大于 0.960，F1 Score 和 mAP50 均大于 0.950，表明模型具有优异的分割和识别效果[4]。
图 2 表型特征 (体长、卵黄囊、头部、眼睛、心包) 的预测结果。
表 1 斑马鱼身体表型参数的模型的统计学结果。
2. 斑马鱼心脏表型的识别和功能参数的计算
基于斑马鱼荧光心脏视频可构建心脏表型模型，用于识别、检测、定量输出心房和心室收缩和舒张的面积和长度 (图 3)。模型对舒张和收缩时心房和心室部位的识别精度均大于 0.970，召回率大于 0.940，F1 Score 和 mAP50 均大于 0.960，表明构建的模型对心脏表型具有良好的分割和识别效果 (表 2) [5]。基于获取的平均心脏荧光数据，可以计算出心率，RR 间期、QT 间期和 QTc 间期指标。基于以上参数，可进一步计算获得以下心脏功能参数，包括 EDV、ESV、EDA、ESA、SV、FS、EF、FAC、CO。
图 3 心脏特征 (收缩和舒张时心室和心房的面积) 模型的预测结果。
表 2 斑马鱼心脏表型参数的模型的统计学结果。
该研究构建了一种基于斑马鱼的集化学品毒性高通量测试、图像采集、身体表型及心脏表型识别及定量分析为一体的方法。基于该方法，系统研究了 15 种新污染物对斑马鱼的毒性。该方法具有识别速度快、准确率高、涵盖评价指标多等优势，能够提高化学品发育和心脏毒性评价的效率和准确度，可用于化学品的早期风险评估和健康预警。
总结
1. ImageXpress Micro Confocal 高内涵细胞分析系统可用于高通量的斑马鱼图像拍摄和心跳视频的获取。
2. 基于拍摄的明场图像，构建了一种基于 YOLOv8 的斑马鱼表型识别 (体长、头部、眼睛、心包、卵黄囊) 及定量分析方法，可用于高风险发育毒性化学品的高通量筛选。
3. 基于心脏荧光视频，采用 YOLOv8 模型和 OpenCV 形态学操作可以对 > 10 种心脏表型及功能参数进行识别、定量分析和计算，可用于高风险心脏毒性化学品的高通量筛选。
致谢
感谢国家自然科学基金 (22376022)、中央高校基本科研业务费 (2412022ZD055) 的资助。感谢 Molecular Devices 公司应用科学家团队对成像方法开发的技术支持工作与市场部推文发表的支持。
作者
张力骁 1，王佳颖 1，王金鹏 2，王宇强 2，王玉茹 2,*，李超 1,*
1 东北师范大学环境学院，长春 130117
2 东北师范大学信息科学与技术学院，长春 130117
注明：作者保留文章内容一切版权。
参考文献
1.Shi H C, Li M, Meng H Y , et al. Reduced transcriptome analysis of zebrafish embryos prioritizes environmental compounds with adverse cardiovascular activities[J]. Environmental Science & Technology, 2023, 57(12): 4959-4970.
2. Zhu F H, Wang J, Jiao J J, et al. Exposure to acrylamide induces skeletal developmental toxicity in zebrafish and rat embryos[J]. Environmental Pollution, 2021, 271: 116395.
3. Park J S, Samanta P, Lee S, et al. Developmental and neurotoxicity of acrylamide to zebrafish[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(7): 3518.
4.李超,张力骁,王宇强,王金鹏,王佳颖,郑煌倩,张雪梅,王羽菲,王玉茹.一种基于YOLOv8的斑马鱼表型识别及定量分析方法，申请号：202410943297.9, 2024.
5. 李超,张力骁,王金鹏,王宇强,郑煌倩,王佳颖,张雪梅,王羽菲,王玉茹.一种AI辅助的高风险心脏毒性的化学品的高通筛选方法，申请号：202411194915.0, 2024.
关于美谷分子仪器
Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。
