利用微孔板读板机高效进行 SNP 基因分型

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因组中的一种 DNA 多态性，其由 DNA 序列中的单个核苷酸变化引起¹，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。由于单核苷酸突变引起的氨基酸取代可能在一定程度上改变蛋白质功能，因此单核苷酸改变为蛋白质功能创造了新的可能²。特定的单核苷酸改变可以改变与农艺性状密切相关的蛋白质功能，进而被用作作物遗传改良的重要工具³。由于单核苷酸多态性位点的不同会影响遗传表型变异，且与性状基因或等位基因完全关联，所以其功能标记作用优于随机 DNA 标记如 RFLPs、SSRs 和 AFLPs，并且被认为是更准确有效的进行基因鉴定和标记辅助⁴。 

SNP 基因分型最早的检测方法之一是 TaqMan 系统，基于荧光标记的等位基因特异性探针，使用基于实时聚合酶链式反应（PCR）的分析进行检测。另一项 SNP 基因分型技术是竞争性等位基因特异性 PCR （KASP），使用终点荧光检测来区分标记的等位基因，用于鉴定和测量发生在核苷酸水平的遗传变异，以检测 SNP。KASP 技术具有低成本、高通量的优点，已广泛应用于人类、动物和植物遗传学领域⁵。

第一步 PCR 循环-模板变性和组分退火：其中一种等位基因特异性引物和通用反向引物与目标 SNP 匹配并结合，扩增目标区域。

第二步 PCR 循环-等位基因特异性末端序列互补链的生成。

第三步 PCR 循环-产生信号：在接下来的 PCR 循环中，等位基因特异性末端序列不断增加，FRET 盒中荧光所标记的序列部分因为从淬灭序列中释放出来而最终产生了荧光信号，可通过荧光微孔板读板机获取荧光信号。

KASP 分析由于其高通量、低成本、灵敏度高和对输入 DNA 的质量和数量变化的耐受性而被广泛用于基因分型。并且适用于各种实时 PCR 仪器或者荧光微孔板读板机。

KASP 技术在种质资源鉴定、亲缘关系研究、分子标记辅助育种、遗传图谱构建与基因定位、种子纯度鉴定等应用广泛。例如，西瓜抗性基因的鉴定，使用 KASP 标记进行 QTL 连锁分析结果进一步绘制了 SNP 标记 KASP_JS9383 和 KASP_JS9168 之间的GSB 抗性位点，进一步为西瓜育种计划中该基因座的标记辅助选择提供有用的工具⁶。

另外，在人类疾病方面，KASP 也发挥了巨大的优势，许多遗传病由点突变或者碱基片段插入缺失导致，KASP 基因分型技术可用于该类型的遗传病检测，如先天性耳聋、白化病、地中海贫血、苯丙酮尿症、家族性遗传性肾炎、色盲、血友病等。通过 KASP 基因分型检测，可以了解是否有易感风险，如心脑血管疾病、自身免疫性疾病、肿瘤或帕金森等，判断个体携带的基因型，从而预知风险，可进行早期干预。例如，通过对 649 例帕金森病患者基因分型，并选择 355 名健康人作为对照组。采用竞争等位基因特异性 PCR （KASP）技术检测两组人群中 rs11868035 和 rs2823357 基因型和等位基因的频率分布。来探索两个功能基因之间的潜在关联 SREBF1 基因 rs11868035 和 USP25 基因 rs2823357 与中国东北地区人群帕金森病病易感性的关系，通过使用 SpextraMax M5 进行检测，最终结果显示多态性 SREBF1rs11868035 基因可能增加中国东北人群对帕金森病的易感性，而 USP25rs2823357 基因可能与中国东北人帕金森病的易感性无关。G/A 变异的 PD 患者可能会加重他们的运动和认知功能障碍⁷。

KASP 技术的应用在全球发表约 3000 余篇科技论文。植物方面涉及水稻、小麦、玉米等主粮作物的功能基因定位和分子标记辅助育种，还有花生、大豆、茶叶、中草药等。畜牧方面主要为牛、羊、驴等。人类医学研究包括糖尿病、结直肠癌、冠状动脉狭窄、动脉瘤、胃癌、听力丧失、阿兹海默、系统性红斑狼疮、关节炎等。

验证试剂盒包含 36 个已知样品，包括 33 个 DNA 样品和 3 个无模板对照 （NTC）。每个样品以 5 µL 量加入 96 孔板中进行 PCR。相同体积的基因分型混合物（2x KASP Master 混合物加 KASP 测定混合物）添加到每孔中。参考染料 ROX 也包含在 KASP Master 混合物中。用干净薄膜密封孔板并以 560 x g 离心一分钟。立即启动热循环反应。热循环反应完成后，每个样品取 5 µL 转移到 384 孔板中，并在微孔读板机中使用表 1 中的 MD 多功能酶标仪参数设置进行检测，本次实验使用 SpectraMax M5e 和 SpectraMax i3x 进行检测。

表 1 读板机设置用于数据采集

ROX 标准化的扩增 DNA 样品荧光在 SoftMax Pro 软件中绘制曲线（图 1）。三个显著的集群被检测出来。FAM 纯合子位置靠近X轴，而 HEX 纯合子则位置靠近 Y 轴，包含 FAM 和 HEX 的杂合样品所形成的的集群在两个纯合子集群之间。无模板对照形成的集群如预期靠近最初位置。所得数据与供应商的验证试剂盒基因分型结果高度一致。

图 1 KASP 基因分型结果。PCR 产物在读板机上得到三个不同集群，包括 FAM 纯合子 ( 蓝色 )，HEX 纯合子 ( 红色 ) 和 FAM/HEX 杂合子 ( 绿色 )。无模板对照(NTC) 集群接近最初位置

SpectraMax i3x 高通量多功能光学检测平台 

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SpectraMax M5e多功能微孔板读板机