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利用 CellXpress.ai 实现 3D 肠道类器官的自动化培养

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2025-04-17
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简介

药物研发管线较高的失败率通常是由于临床前阶段到临床阶段的转化效率低。由于类器官更接近于人体组织的结构和功能,并对药物反应具有更高的预测性,因此在疾病建模和药物筛选方面显示出了巨大的前景。然而,目前类器官在实际应用过程中存在一系列的挑战,如检测方法复杂、可重复性低和大规模生产困难等,限制了其在药物发现中的广泛应用。




为了缓解耗时耗力重复劳动多的人工实验带来的瓶颈,我们开发了 CellXpress.ai 体外模型智能化工厂。这一创新性的解决方案可利用机器学习自主管理换液、铺板、传代、类器官生长监测、终点检测和复杂图像分析,实现整个类器官长期、复杂的培养流程的自动化。在这里,我们介绍了几种常用的类器官培养方法的自动化实验结果,包括基质胶或低附着板中的 3D 类器官培养。我们首先在基质胶 ( 24 孔板 ) 中培养、传代和扩增正常小鼠肠道类器官。通过自动更换培养基培养类器官,每 24 小时成像监测一次。5-6 天后,自动收集类器官,从基质胶中纯化并打散,然后与新鲜基质胶混匀后重新铺板完成传代过程。在生长过程中,类器官会自组织形成复杂的隐窝结构。


我们在透射光下监测类器官的形态,利用基于机器学习的图像分析模型评估类器官的数量、大小 ( 按面积 ) 和光密度。在终点试验 ( 96 孔 ) 中,我们对类器官进行活性标记染色,检测化合物对健康肠道类器官 ( 毒性评估 ) 或患者源性结直肠癌类器官 ( 药物筛选 ) 的作用浓度和时间依赖性。


由机器学习决策驱动的细胞培养过程自动化具有巨大的应用潜力,可提高类器官培养通量和可重复性,将 3D 生物学提升到更高水平。


优势

❖

从设置到数据分析的整个细胞培养过程实现自动化。在机器学习的支持下,自动化工作流程使检测更加可靠和可重复。

❖

通过标准化的基质胶点样和类器官传代实现复杂肠道类器官工作流程的自动化。

❖

基于成像的形态测量可用于触发程序中的下一步 ( 例如传代 )。




方法


01

机器

功能强大的全新 CellXpress.ai 体外模型智能化工厂通过整合培养箱、液体工作站和基于图像决策的人工智能软件,可自动完成整个细胞和类器官的培养过程。这种自动化解决方案利用定期成像和分析来监测细胞模型的开发,管理繁琐的换液和传代过程,并利用机器学习实现自动决策,从而启动下游传代、终点检测或故障排除步骤。


在 ImageXpress Confocal HT.ai 智能化共聚焦高内涵成像系统 (Molecular Devices) 上,使用 MetaXpress 高内涵图像采集和分析软件采集荧光 (FL) 图像。对于肠类器官,利用共聚焦模式,在 4X 或 10X 下采集 Z-stack 图像,通过 MetaXpress 或 IN Carta 软件进行图像分析。


02

细胞培养方案


使用既定方法 (STEMCELL Technologies) 从原代小鼠肠细胞中提取并培养 3D 肠类器官 *。根据 STEMCELL  Technologies  的实验步骤对细胞进行培养和分化,加入 IntestiCult 类器官生长培养基 ( STEMCELL 技术 ),将细胞以 24 孔板形式接种在生长因子减量 50% 的  Matrigel 或 Cultrex (Corning) 圆顶中,每隔一天更换新鲜培养基。培养 7-10 天后,将肠类器官传代解离并重新铺板至新鲜的基质胶圆顶中。


图 1 CellXpress.ai 体外模型智能化工厂的组件和功能。


03

3D 类器官自动化培养


根据 STEMCELL Technologies 推荐的小鼠肠类器官基本方案, 在 24 孔板中,每孔加入 40-50μl、50-60% Matrigel 或 Cultrex,在基质胶圆顶中进行类器官培养和传代。


铺板接种:将基质胶中的类器官悬浮液置于预冷的 96 孔深孔板中,用 4 个移液管吸头吸干悬浮液,并分装到 24 孔板中,每次 4 个吸头。另外,我们也测试了普通 96 孔板。


换液:培养基的去除和新鲜培养基的添加,一次 4 个孔。


类器官成像 / 监测:使用 CellXpress.ai 体外模型智能化工厂完成 2X 或 4X 物镜下的透射光成像后,利用基于机器学习的分析方法进行图像分析。这里主要分析评估类器官的数量、平均面积和总面积、密度以及其他参数。每 4 天传代一次,或根据用户需要设置,或根据一个或多个选定的参数 ( 如总面积或类器官密度 ) 进行自动决策。


类器官传代:对于类器官传代,我们针对小鼠类器官的工作流程优化了移液和离心的组合步骤。流速、移液步骤和重复次数、离心速度等可通过参数微调进行个性化定制。传代时,先移除培养基,将基质胶圆顶与温和的细胞解离试剂一起孵育后,反复吹打破坏基质胶圆顶。随后将混合物收集到 96 深孔板中,然后将两个孔合并成一个孔,在外置离心机上 400g 离心 5 分钟。接着将板放回,去掉培养基,冲洗类器官一次。第二次离心后,吸掉大多数上清,然后使用小吸头反复吹打破坏类器官。最后加入新鲜基质胶到适当体积,混合成细胞悬液后接种到新板中。


类器官染色 / 成像:类器官染色后使用 ImageXpress Confocal HT.ai 智能化共聚焦高内涵成像系统进行荧光成像。

图 2 类器官自动化培养和传代方案示意图。


04

自动化类器官工作流程


图 3 类器官培养和传代的主要步骤。


包括接种、培养基交换、肠类器官的监测和传代是使用预先设定的方案“ 阶段 ”进行编程的。


第一阶段是接种,该阶段可对将基质胶类器官放入 24 孔板的步骤进行编程。


程序的下一阶段包括更换培养基 / 监控 / 传代步骤,时间及参数由用户定义。


图 4 类器官培养和传代软件设置。



结果


我们持续培养肠道类器官已超过一个月。类器官基质胶圆顶的自动接种可实现 24 孔板中圆顶的一致大小和精确居中,从而使成像和图像分析更轻松、更准确。类器官在自动化培养过程中按预期生长,形成符合典型肠道类器官形态的隐窝结构。孔间的类器官分布和数量一致。每天使用 2X 物镜拍摄图像,并使用预训练的机器学习模型。图像分析可以识别类器官,也可以确定类器官的数量、平均面积和总面积、类器官密度、圆度、颗粒度和其他形态标准。该软件允许在培养过程中查看类器官图像,还可提供动态分析和表示各种测量的时程图。数据也可以导出到 Excel 数据表中,以进行额外分析。图 6 显示了随时间推移类器官面积和数量的变化。


图 5 A. 在连续培养的不同时间点拍摄的类器官代表性图像  (4X)。B. 类器官分析图示:类器官计数和随时间推移产生的偏度。偏度是包括光密度、粒度和其他光学参数的组合,该值在定义类器官传代时间方面非常有用。C. 单个孔的类器官图像随时间的变化,显示“ 细胞进程 ”。D. 24 孔板类器官圆顶的 4x 图像拼接。


图 6 随时间变化的类器官计数和类器官面积总和。根据 24 个孔计算平均值和标准差。




 总结 



• 类器官技术被认为是疾病建模和药物筛选的改变者,因为它们更类似于组织结构和功能,并对药物表现出更具预测性的反应。

• 如检测复杂性、缺乏可重复性以及扩大筛选规模的能力,这些挑战限制了类器官作为药物发现的主要筛选方法的广泛应用。

• 在这里,我们展示了研究人员如何缓解劳动密集型复杂方案带来的瓶颈,以提高药物筛选的效率。

• CellXpress.ai 体外模型智能化工厂是一个功能强大的全新解决方案,可使实验室实现从实验方法设置、筛选到数据分析的整个细胞培养过程的自动化,并且通过机器学习驱动的工作流程使检测更加可靠、可重复。

• 以成像和机器学习控制决策为动力的自动化细胞培养具有巨大的潜力,通过提高生产量和可重复性,将三维生物学提升到一个新的水平,进而推动高通量药物发现和精准医学的应用。



关于美谷分子仪器


Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷,并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年,Molecular Devices 在上海设立了中国代表处,2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团,2011 年正式成立商务公司:美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内,我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。




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