细胞和基因治疗领域应用专栏（二）：突破性 CAR-T 技术

胞外：结合肿瘤相关抗原（TAA）的 scFV 片段，例如肿瘤细胞的 CD19 、BCMA  等都是 TAA ；以及提供柔韧性和长度空间的铰链。

跨膜：通常是横跨细胞膜的疏水α螺旋，是受体表面表达和稳定的基础，常用 CD8α、CD28。

胞内：发挥主要功能的信号转导域ITAM，共刺激域，细胞因子相关的其它信号域。

第一代：包含一个抗原结合域，该域直接融合到 TCR 不变链 CD3ζ 的细胞内部分。第一代 CAR 通过磷酸化 CD3ζ 中基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM) 域来启动激活级联反应。该信号不足以激活 T 细胞，需要外源性给予细胞因子。因此，最初的临床试验产生了令人失望的结果。

第二代：将来自其他受体（如 CD28、4-1BB ）的共刺激结构域整合到 CAR 的细胞内片段中，提高激活、增殖和存活率。这一概念在一项临床研究中得到了证明，将 CD28 作为共刺激掺入 CD19 CAR-T 细胞导致了细胞扩增和存活率增加。2003 年和 2004 年分别基于 CD28 和 4-1BB 构建二代 CAR-T。

第三代：结合了几个信号域，期望能增强T 细胞的活化、增殖和存活。然而，在实践中，这种方法提供的临床益处仍在讨论中。

第四代：引入了一个细胞内结构域，能够触发由细胞因子诱导的第 3 信号。

第五代：通用型 CAR-T，即在异体志愿者体内获取T细胞并敲除相关免疫原性基因输注至患者体内，目前安全性仍处于早期探索阶段。CAR-T 的整个生产总体可分为质粒、病毒和细胞产品三个部分。

细胞培养：使用 Hela 细胞系形成 3D 细胞球，T细胞从冷冻保存的 PBMC 小瓶中解冻并刺激，然后与细胞球共培养。

随后进行细胞球成像：使用 ImageXpress Micro Confocal 高内涵系统和 MetaXpress 软件进行成像。然后进行图像分析：使用深度学习模块 SINAP 进行分割，用 Phenoglyphs 进行分类。