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细胞和基因治疗领域应用专栏(二):突破性 CAR-T 技术

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2025-04-09
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应用实例二:细胞治疗应用实例

细胞基因治疗通常可以被粗略的分为两大类,一类是细胞治疗,指的是利用人体免疫细胞(T细胞、NK细胞等),改造或不经过改造再重输回人体,从而达到治疗效果的疗法。另一类则是基因核酸治疗,是基于核酸水平起效,包括围绕 DNA 的基因替代与基因编辑,和围绕 RNA 的 RNA 干扰、激活和 mRNA 等的疗法。


小分子和单抗药物的作用机理是影响已生成的蛋白质发挥功能,而细胞和基因治疗(Cell Gene Therapy,CGT)是基于中心法则,由 DNA 合成出 RNA,再由 RNA 合成出蛋白质,继而从上游调节蛋白质的生成和功能,因此被认为可能是最终的疾病治疗解决方案。当前在细胞基因治疗领域中,发展最快最成熟的当属 CAR-T。


构建 CAR(嵌合抗原受体)可以在空间上分为三个结构域:

  • 胞外:结合肿瘤相关抗原(TAA)的 scFV 片段,例如肿瘤细胞的 CD19 、BCMA  等都是 TAA ;以及提供柔韧性和长度空间的铰链。

  • 跨膜:通常是横跨细胞膜的疏水α螺旋,是受体表面表达和稳定的基础,常用 CD8α、CD28。

  • 胞内:发挥主要功能的信号转导域ITAM,共刺激域,细胞因子相关的其它信号域。


随着 CAR 胞内结构域改进, CAR-T 技术也在不断迭代:

  • 第一代:包含一个抗原结合域,该域直接融合到 TCR 不变链 CD3ζ 的细胞内部分。第一代 CAR 通过磷酸化 CD3ζ 中基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM) 域来启动激活级联反应。该信号不足以激活 T 细胞,需要外源性给予细胞因子。因此,最初的临床试验产生了令人失望的结果。

  • 第二代:将来自其他受体(如 CD28、4-1BB )的共刺激结构域整合到 CAR 的细胞内片段中,提高激活、增殖和存活率。这一概念在一项临床研究中得到了证明,将 CD28 作为共刺激掺入 CD19 CAR-T 细胞导致了细胞扩增和存活率增加。2003 年和 2004 年分别基于 CD28 和 4-1BB 构建二代 CAR-T。

  • 第三代:结合了几个信号域,期望能增强T 细胞的活化、增殖和存活。然而,在实践中,这种方法提供的临床益处仍在讨论中。

  • 第四代:引入了一个细胞内结构域,能够触发由细胞因子诱导的第 3 信号。

  • 第五代:通用型 CAR-T,即在异体志愿者体内获取T细胞并敲除相关免疫原性基因输注至患者体内,目前安全性仍处于早期探索阶段。CAR-T 的整个生产总体可分为质粒、病毒和细胞产品三个部分。

CAR-T。


实验方法举例:

实验对比未处理的细胞球(对照)、与未刺激的与 PBMC 混合细胞球、刺激的 PBMC 混合的细胞球以及用星形孢菌素处理的阳性对照细胞球。

  • 细胞培养:使用 Hela 细胞系形成 3D 细胞球,T细胞从冷冻保存的 PBMC 小瓶中解冻并刺激,然后与细胞球共培养。

  • 随后进行细胞球成像:使用 ImageXpress Micro Confocal 高内涵系统和 MetaXpress 软件进行成像。然后进行图像分析:使用深度学习模块 SINAP 进行分割,用 Phenoglyphs 进行分类。

实验设计流程。


结果显示 T 细胞诱导的 Hela 细胞球表型变化如下:

观察到细胞球发生了大小、荧光强度等变化。基于机器学习的细胞球分类:通过训练模型,能够准确地将细胞球分类为 5 类,预测准确率约为 97%。分析了面积、形状因子、总强度和灰度不均匀性等关键特征的趋势。使用高内涵成像监测了T细胞处理的 3D 细胞球的生长和表型变化并成功生成了 SINAP 人工智能模型并在 Phenoglyphs 中训练了分类分析模型,概述了四个关键特征,为未来类似实验提供了有用信息。


成像和分析结果左侧为人工智能明场分析,右侧为原始图像 mitotracker (细胞球, 红) and celltracker (T cells, 绿)。

细胞球荧光强度随时间变化。

细胞球随时间面积变化。


可见,ImageXpress Micro Confocal 高内涵系统不仅能够进行自动化的 3D 成像和分析,而且其配套的人工智能分析有能力分析明场下的混合样品。


应用实例中涉及的系统:


ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像系统,可以全自动高分辨的成像,并分析亚细胞结构的变化,获得高质量图像的同时获得科学准确的定量数据。


结 语

Molecular Devices 作为一家有 40 年历史的老牌生命科学仪器企业,其产品线覆盖细胞和基因治疗(Cell and Gene Therapy,CGT)领域非常广泛的应用方向。从基因治疗到细胞治疗,甚至能覆盖到相关的抗体生产和细胞系建立流程,由于我们的仪器覆盖酶标仪,高内涵等科研领域常用仪器,所以以上列举的应用仅能体现我们众多仪器设备应用中的一小部分。可以通过访问官方网站:www.moleculardevices.com.cn来获取更多资源。




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