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数字PCR与基因编辑育种——番茄基因组倒位频率检测，助力番茄育种

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2024-11-14

导读

染色体倒位(inversion)是由于同一条染色体上发生了两次断裂，产生的片段颠倒180度后重新连接造成的。染色体倒位现象在植物中广泛存在，对植物育种来说是有利又有弊。有利之处在于染色体倒位可能改变减数分裂过程中基因的重组频率，促进物种进化，为生物育种提供了新的策略。不利之处在于倒位也可能对受精和胚胎发育过程产生不良影响，导致生育能力降低或产生遗传异常的后代。

（图源：网络，侵删）

基因编辑是在植物中诱发或者逆转倒位突变的有效方法，为修改局部重组率提供了有效机制。最近，荷兰瓦赫宁根大学的研究团队在bioRxiv上发布了题为“ Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato ”的文章。作者运用CRISPR/Cas9技术在番茄6号染色体上诱导了一系列从1 kb到37.5 Mb不等的倒位，使用数字PCR方法验证倒位事件的发生，其结果与测序结果高度一致。本文深入探究了CRISPR/Cas9技术诱导染色体倒位的实验方法和影响因素，为精准育种开辟了新路径。

应用亮点：

▶ 首次系统地探讨了CRISPR/Cas9在番茄中诱导基因组倒位的关键机制，揭示了不同因素对倒位发生频率和类型的影响。

▶ 创新性地应用naica®微滴芯片式数字PCR系统对CRISPR/Cas9诱导的基因组变化进行高灵敏度和定量分析，为监测基因组编辑结果提供了更为精准的工具。

实验结果：

⒈ 倒位片段长度与倒位诱导频率的关系：作者设计了十三个CRISPR/Cas9构建体，每个构建体含有两个靶向番茄染色体6特定位点的gRNA，一个是固定的参考gRNA，另一个是可变gRNA。通过这些构建体诱导了一系列1 kb到37.5 Mb不等的倒位，发现倒位大小对诱导频率的影响微乎其微，除非大于1Mb的倒位。对于长片段的倒位，无论gRNA切割效率如何，其倒位频率都会大幅地下降。作者提出了假设，长片段倒位形成的频率较低可能是因为这些片段运输到修复部位的过程中，受到其尺寸的阻碍。

▲图1，使用固定gRNA的平均突变频率对转染效率进行校正后得到的可变gRNA突变频率(%)（纵坐标）

⒉不同方法验证：作者将CRISPR/Cas9构建体转染到原生质体中，利用naica®微滴芯片式数字PCR系统 (cdPCR)鉴定倒位事件。同时，利用Hi-Seq测序技术检测了固定和可变gRNA靶点上双链断裂(DSB)位点的突变（1kb-3kb），进一步验证突变和倒位事件的发生的频率。这种双重方法能够将倒位频率与突变诱导频率联系起来。结果发现，两种检测技术的结果高度一致，检测的倒位频率相当。

▲图2c：naica 数字PCR微滴质控图，蓝色圈表示阳性微滴，代表倒位事件的发生

▲图2b：通过PacBio Sequel II测序(绿色)和cdPCR (蓝色) 检测到的1kb和3kb大小的倒位事件频率

⒊ 修复机制：作者假设了植物细胞内可能存在一种未被完全理解的非同源末端连接（NHEJ）修复机制，利用受损染色体部分的主动运输到细胞核中的专用修复位点来完成修复。

⒋ 倒位频率的瓶颈：作者发现，可变gRNA的切割能力较低时，倒位的频率也将下降，可变gRNA的切割能力可能是诱导倒位的关键因素。

结论：

倒位事件在细胞群体中的发生频率通常较低，长片段（如超过1 Mb）倒位事件频率更低。cdPCR较传统PCR方法，具备更高灵敏度，使其能够检测到这些低频事件。研究团队使用cdPCR检测到的倒位事件与PacBio Sequel II测序数据高度一致，验证了cdPCR在倒位检测中的可靠性。这项研究不仅增进了我们对基因编辑过程中染色体结构变异的理解，也为植物育种提供了新的策略，通过调控倒位频率，可以更精准地改良作物特性，培育出更优质的番茄品种。

参考文献：

Jillis Grubben, Gerard Bijsterbosch, Richard G.F. Visser, Henk J. Schouten. (2024). Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato. bioRxiv. doi:10.1101/2024.01.09.574821

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