【用户成果】Sony ID7000™助力造血干细胞研究

分析小鼠HSPCs的单细胞RNA数据揭示Trim47在原始HSC的C1簇中富集。qPCR和免疫荧光验证了Trim47在LT-HSCs中的高表达，而在其他细胞中表达较低。研究者创建了Trim47⁺/eGFP小鼠模型，通过同源重组引入2AeGFP基因，用ID7000™分析确认了骨髓中eGFP⁺细胞特异表达Trim47。Trim47^+/+与Trim47^+/eGFP小鼠的Trim47表达和HSC功能相似，证实了模型的可靠性。在Trim47^+/eGFP小鼠中，LT-HSCs的Trim47表达最高，eGFP⁺细胞在特定HSPC标记物上更富集，暗示Trim47在HSC生物学中的关键作用。

研究发现，Trim47高表达的HSCs（eGFP^hi）在G0期的比例增加，而G1和S/G2/M期的比例减少，表明高Trim47表达与HSC静止状态相关。此外，eGFP^hi HSCs在培养中产生更多后代细胞，并具有更强的集落形成能力。移植实验显示，eGFP^hi HSCs在受体小鼠中显示出更高的嵌合水平。RNA测序分析揭示，与eGFP^lo HSCs相比，eGFP^hi HSCs中有1480个基因上调，1157个基因下调。基因集富集分析（GSEA）显示，eGFP^hi HSCs中与HSC特征、长期造血和干细胞特征相关的基因集富集，而eGFP^lo HSCs中与谱系特征、细胞周期检查点和动员的HSC特征相关的基因集富集。这些数据表明，高Trim47表达是HSCs强大自我更新能力的可靠标志。

在正常造血条件下，Trim47缺失的小鼠（Trim47^-/-）与野生型（WT）小鼠相比，外周血计数和骨髓细胞总数没有差异，HSPCs的频率和绝对数也相似。然而，在5-FU化疗或辐射（IR）应激下，Trim47^-/-小鼠显示出更明显的白细胞、血小板和红细胞减少，且在连续5-FU注射下更早死亡。在5-FU应激后，Trim47^-/-小鼠的HSPCs频率和数量显著降低，且功能性HSCs的频率减少。这些缺陷的HSC表型在移植后仍可观察到。此外，亚致死剂量的IR应激也在Trim47^-/-小鼠中引起了类似的造血变化。这些结果表明，Trim47是调节短期应激下造血的关键因素。

缺失Trim47的HSCs在初次和二次移植中产生的外周血嵌合水平低于野生型对照组，且随着时间推移差异逐渐增大。尽管Trim47缺失后HSCs的谱系分布未改变，但骨髓重建能力出现类似下降。在5-FU应激下进行的HSC移植实验中，Trim47缺失的HSCs重建功能进一步下降，谱系分布依旧不变。此外，在应激条件下，Trim47缺失小鼠的EPCR⁺ SLAM-HSCs集落形成能力显著低于野生型小鼠。互惠性骨髓移植和归巢实验显示，Trim47缺失的HSCs重建能力的损害并非由于微环境或HSC归巢能力的缺陷。这些结果表明，Trim47在应激期间以细胞内在的方式促进HSC的维持中发挥着重要作用。

与野生型相比，Trim47缺失小鼠的LT-HSCs在静止状态下G0期的比例略有下降，而在5-FU应激下HSCs的静止状态显著降低。此外，Trim47缺失加速了HSCs的增殖，但减缓了小鼠的造血恢复，特别是在5-FU处理后，Trim47缺失的HSCs显示出显著增加的凋亡率。RNA测序分析显示，与野生型相比，5-FU处理后Trim47缺失的HSCs中有817个基因表达差异，而未处理组中只有355个基因表达差异。基因集富集分析（GSEA）显示，与HSC维持相关的基因集在5-FU处理的Trim47缺失HSCs中下调，而与HSC增殖相关的基因集上调。这些数据表明，Trim47在应激条件下维持HSCs的静止和存活。

研究表明，5-FU刺激导致dsRNA产生，激活MDA5-MAVS信号轴，进而触发炎症反应和HSCs增殖。Trim47缺失的HSCs在5-FU后炎症信号增强，MAVS蛋白上调，炎症因子IL-6、TNF和IFN-β分泌增多。Noxa表达增加导致这些HSCs凋亡，而Noxa抑制减少凋亡。这些结果表明，Trim47缺失导致MAVS介导的炎症反应过度激活，这可能是HSCs在应激下静止减少和凋亡增加的原因。

研究发现，在Trim47缺失后MAVS蛋白表达增加而mRNA水平未变，推测Trim47可能通过泛素化促进MAVS的降解。实验中，过表达Flag标记的Trim47增强了Myc标记的MAVS的K48链接泛素化水平，而Trim47基因敲除则降低了小鼠5-FU应激后MAVS的K48链接泛素化水平。通过慢病毒介导的MAVS短发夹RNA（shMAVS）敲低MAVS，发现这显著抑制了Trim47缺失HSCs中TBK1-IRF3和IKKα/β-NF-κB途径的激活以及Noxa表达。重要的是，MAVS的敲低部分恢复了Trim47缺失HSCs的细胞周期、凋亡和造血重建能力。因此，这些结果表明Trim47主要通过调节MAVS的泛素化降解来促进HSCs在造血应激期间的维持。

使用lineage marker, Sca-1, c-Kit, CD34,Flk2, EPCR (CD201), CD150, CD48, CD16/32, CD127, Gr-1, CD11b, B220,CD3e, CD45.1和CD45.2荧光抗体，对小鼠骨髓细胞进行造血细胞表型分析。 

• 长期 HSCs (LT-HSCs, Lin^- Sca1⁺ c-Kit⁺ CD34^- Flk2^-), 

• 短期 HSCs (ST-HSCs, Lin^- Sca1⁺ c-Kit⁺ CD34⁺ Flk2^-), 

• 多能祖细胞 (MPPs, Lin^- Sca1⁺ c-Kit⁺ CD34⁺ Flk2⁺), 

• 淋巴细胞祖细胞 (CLPs, Lin^- CD127⁺ Sca1^med c-Kit^med), 

• 巨核细胞红细胞祖细胞 (MEPs, Lin^- Sca1^- c-Kit⁺ CD16/32^- CD34^-), 

• 粒细胞单核细胞祖细胞 (GMPs, Lin^- Sca1^- c-Kit⁺ CD16/32⁺ CD34⁺), 

• 髓系祖细胞 (CMPs, Lin^- Sca1^- c-Kit⁺ CD16/32^- CD34⁺)

并结合使用以下抗体：anti-Ki67, anti-BrdU, anti-Annexin V, anti-Phospho-NF-κB p65 (Ser536), anti-MAVS, anti-MDA5, anti-Phospho-TBK1/NAK (Ser172), anti-Phospho-IRF3 (Ser396), anti-Phospho-IKKα/β(Ser176/180), anti-Noxa进一步检测细胞周期、凋亡、增殖或信号转导等功能表现。

图 2 | Trim47表达代表具有增强静止和自我更新能力的HSCs。A 流式门控区分Trim47^+/eGFP小鼠骨髓中eGFP^lo、eGFP^mid和eGFP^hi的LT-HSCs。Trim47^+/+小鼠作为阴性对照。B 对Trim47^+/eGFP小鼠骨髓中的eGFP^lo、eGFP^mid和eGFP^hi LT-HSCs进行细胞周期分析（n = 5）。C 检测Trim47^+/eGFP小鼠骨髓中eGFP^lo、eGFP^mid和eGFP^hi LT-HSCs的BrdU⁺细胞比例（n = 6）。D 在培养9天后，对来自Trim47^+/eGFP小鼠骨髓的eGFP^hi或eGFP^lo LT-HSCs（1 × 10^3）的LSKs百分比进行分析（n = 5）。